慢性束缚应激对小鼠毛囊细胞生长周期的影响

慢性束缚应激对小鼠毛囊细胞生长周期的影响
刘楠¹，马占波^2@，傅文青^1@，张国兴¹，王琳辉¹，王晓娟¹
(¹苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123；²河北省衡水市东亚白癜风医院，河北衡水053000；通信作者：傅文青，fuwenqing@suda.edu.cn；马占波，mzb@066000.com)

[摘要]目的：探讨慢性束缚应激诱导的皮肤氧化应激对小鼠毛囊细胞生长周期的影响。方法：以慢性束缚法建立小鼠心理应激模型，观察行为学和皮肤组织形态学改变，检测血浆皮质醇水平，皮肤组织中硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)水平，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力。结果：与控制组相比，束缚组小鼠运动距离显著减少（P＜0.05），血浆皮质醇和皮肤TBARS水平显著上升(P＜0.05,P＜0.001)，SOD、GSH-Px活力显著降低(P＜0.05,P＜0.001)，毛囊生长期明显延迟；束缚加抗氧化剂组小鼠，皮肤组织TBARS水平、GSH-Px活力与控制组无明显差异，可部分逆转毛囊生长期延迟。结论：慢性束缚应激引起的皮肤组织氧化应激导致小鼠毛囊生长期延迟。
[关键词]慢性束缚应激；氧化应激；毛囊周期
Chronic restraint stress induced oxidative stress and delay the anagen cells stage in skin of mouse
Liu Nan¹，MA Zhan-bo^2@，Fu Wen-qing^1@，ZHANG guo-xing¹，WANG lin-hui¹，WANG xiao-juan¹
¹School of Biology & Basic Medical Sciences, Soochow University, Soochow Jiangsu 215123；²Dongya vitiligo Hospital, Hengshui Hebei 053000; Corresponding author: Fu Wen-qing, Email: fuwenqing@suda.edu.cn；MA Zhan-bo，Email：mzb@066000.com
[Abstract]Objective: To investigate the effects ofoxidative stress inducedby chronic restraint stress on hair cycle of mouse. methods: Used chronic restraint to establish the psychological stress model in mouse, observed the change ofbehavior and skin tissue morphology,detected cortisol levelsin plasma,thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) levels, superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) activity in skin. Results:Compared with the control group, mouse movement distance of restraint group decreased significantly (P＜0.05), plasmacortisol and skin TBARS levels was increased significantly (P＜0.05,P＜0.001),SOD and GSH-Px activity were decreased significantly(P＜0.05, P＜0.001), anagen was significantly delayed; Compared with the control group, TBARS levels and GSH-Px activity were no significant difference in mouseof restraint added anti-oxidants group, delay of anagen was partly reversed.Conclusion:The oxidative stress inducedby chronic restraint stress of skin tissue delayed anagen in hair cycle of mouse.
[Key words]chronic restraint stress, oxidative stress, hair cycle

脱发是一系列可见性毛发减少疾病的总称，大多数类型的脱发是由于毛囊周期异常和毛囊形态学改变引起的^[¹^]。应激一直被认为是脱发的诱因之一，但一直未有确凿证据证明应激可以抑制毛发生长^[²^]。Aoki等发现慢性足底电击可以导致C57小鼠毛囊静止期延长^[³^]，而Arck用24小时的噪声刺激使C57小鼠毛囊退行期提前^[⁴^]，这些研究结果都表明应激确实可以影响毛囊周期，但确切机制尚不清楚。氧化应激与皮肤疾病密切相关，皮肤抗氧化系统的抑制导致活性氧自由基（ROS）堆积而对细胞产生损伤，外界环境或皮肤本身都可以产生ROS，而作为人体最外层的皮肤是活性氧自由基的主要靶器官^[⁵^]。以往研究中建立动物心理应激模型多采用急性应激^[⁶^]，或躯体成分较大的足底电击^[3]，不能较好的模拟人类慢性情绪应激反应。慢性束缚应激可以造成动物焦虑和抑郁状态且躯体应激成分相对较小，并可以引起动物全身多器官的氧化应激损伤^[⁷^,⁸^]，故本研究采用了慢性束缚应激法。实验中先用脱毛法诱导小鼠背部毛囊同步进入生长期，然后给予慢性束缚应激，分别从肉眼和形态学两方面观察毛囊生长周期的改变并检测皮肤中硫代巴比妥酸反应产物（TBARS）水平、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)酶活力，并通过观察抗氧化剂的作用来探讨皮肤氧化应激损伤是否为心理应激抑制毛囊生长的机制之一。

1．对象与方法
1.1 实验动物
6~8周龄C57BL/6N小鼠42只（雄性，体重15~20g），由苏州大学实验动物中心提供。所有动物在温度20士2℃，湿度50~60%，白昼/黑夜周期为12h/12h（7:00~19:00照明）条件下适应环境7天后开始实验，每3天更换一次笼舍和垫料。实验中除应激期间外均自由饮水及摄食。
1.2 慢性束缚应激和腹腔注射Tempol
采用脱毛法诱导小鼠毛囊同步进入生长期^[4]，使用松香和石蜡（重量1:1）混合物脱去小鼠背部毛发，面积约2 cm×5 cm（从颈到尾）。慢性束缚装置按文献所述自制^[⁹^]，将50ml离心管管壁不同部位钻出直径3mm左右的小孔，以防止小鼠窒息。将小鼠头朝向管底放入离心管内后封闭管口，头端稍高于尾端放置，每天6 h（10:00~16:00），束缚期间禁食禁水，6h后将小鼠恢复自由。从脱毛后第一天开始应激，周期为18天。
Tempol（4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基）是一种稳定的，能够自由透过细胞膜的抗氧化剂，是SOD的类似物，小鼠腹腔注射Tempol的最大耐受量为275mg/kg体重^[¹⁰^]。将Tempol粉剂（美国sigma公司）溶于双蒸水中制得浓度为20g/L的Tempol溶液，本实验选择注射剂量为200mg/kg体重。将所有小鼠随机分为：1、控制组（14只）：不进行应激处理，但在束缚组应激期间也不给予饮水及饲料；2、束缚组（14只）：每天6h 束缚应激，不进行腹腔注射；3、束缚+Tempol（14只）：每天6h束缚应激，每只小鼠按200mg/kg体重腹腔注射Tempol溶液。
1.3行为学评估和体重测量
从束缚第1天起每天测量小鼠体重并记录，束缚应激周期结束后，使用开场实验仪器（成都泰盟科技有限公司）记录小鼠3min内运动距离并录像。在整个检测过程中，房间需保持安静。
1.4 标本采集
脱毛后第9天小鼠背部毛囊处于生长晚期，控制组小鼠皮肤呈现深灰色^[¹¹^]，每组以摘眼球取血法（麻醉下）随机处死7只小鼠，取得血液肝素抗凝，离心，取上清液-80℃保存。切取小鼠背部相同位置皮肤组织约2cm×5cm，将靠近颈部约1cm×1cm立即用4%福尔马林(pH7.4)固定，常规方法脱水，石腊包埋。因颈部毛囊周期变化先于其他部位^[4]，故选取此部位作组织学观察。剩余皮肤-80℃保存。脱毛后第19天，以同样方法处理剩余小鼠。
1.5 血浆皮质醇浓度测定
血液样本使用小鼠糖皮质激素Elisa试剂盒（苏州碧云天生物技术研究所）测定血浆皮质醇浓度。
1.6 测定TBARS水平、SOD、GSH-Px活性
按照试剂盒要求制备组织匀浆，以BCA蛋白浓度测定试剂盒（苏州碧云天生物技术研究所）定量蛋白，使用TBARS测定试剂盒（美国BioAssay Systems公司）测定皮肤组织TBARS水平。使用SOD、GSH-Px测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定皮肤组织SOD、GSH-Px活力。
1.7 肉眼观察皮肤颜色变化
每天应激前拍照记录小鼠背部皮肤颜色变化（日本松下公司DMC-FS15型相机）。利用Image J软件对小鼠皮肤颜色进行灰度分析。
1.8 组织学观察
取皮肤纵切面HE染色切片，根据Arck等的方法对毛囊进行分期并评分^[4]，生长期为1-4分（anagen I-II：1分；anagen IIIa-IIIb：2分；anagen IIIc-IV：3分；anagen V-VI：4分），退行期为1-4分（catagen I-II：1分；catagen III-IV：2分；以此类推）。每个切片选取十个视野（×100），计数总毛囊个数，然后对单个毛囊评分，总分相加后再除以总毛囊个数求得毛囊平均分。
1.9 统计学处理
数据以表示, 两组间采用spss19.0软件进行独立样本双尾 t 检验,P <0.05具有显著性差异。

2．结果
2.1 行为学评估和体重
与控制组相比较，束缚组和束缚+Tempol组小鼠在放入开场箱后3min内的运动距离显著降低（P <0.05）（见表1），体重增长显著减慢（P <0.05）（见表2）。
表1不同应激天数各组小鼠运动距离

组别	运动距离(cm)
组别	9 天	19天
控制组	3026.15± 386.65	2918.14± 365.55
束缚组	2013.39± 147.95^*	1477.45± 213.49^*#
束缚+Tempol	1969.60±134.19^*	1741.03± 57.67^*

与控制组比较，*P<0.05，与束缚组比较，#P<0.05
表2不同应激天数各组小鼠体重

组别	体重(g)
组别	0天	4天	9天	14天	19天
控制组	20.51±0.71	20.88±0.62	22.30±0.65	24.05±0.54	24.26±0.69
束缚组	20.06±0.47	18.79±0.42*	19.67±0.41*	20.96±0.48*	21.19±0.47*
束缚+Tempol	20.89±0.37	18.90±0.45*	20.56±0.44*	20.77±0.85*	21.14±0.83*

与控制组比较，*P<0.05
2.2 血浆皮质醇水平
以控制组均值为100%，求得其他各组血浆皮质醇水平百分数。与控制组相比较，束缚组和束缚+Tempol组血浆皮质醇水平明显升高（P＜0.05）（见表3）。
表3不同应激天数各组小鼠血浆皮质酮水平

组别	血浆皮质酮水平(ng/L)
组别	9 天	19天
控制组	38.83 ± 2.05	40.00 ± 0.59
束缚组	48.79 ± 3.28^*	46.73 ± 2.26^*
束缚+Tempol	48.01 ± 2.23^*	47.71 ± 1.81^*

与控制组比较，*P<0.05
2.3 TBARS水平、SOD、GSH-Px活力
与控制组相比较，脱毛后第9天和第19天束缚组皮肤TBARS水平均显著升高（P <0.05），SOD、GSH-Px活力显著降低（P <0.05，P <0.001），束缚+Tempol组皮肤TBARS水平、GSH-Px活力与控制组无明显差异，SOD活力则显著下降（P <0.001）。与束缚组相比较，束缚+Tempol组TBARS水平显著降低（P <0.001）（见表4、5、6）。

表4不同应激天数各组小鼠皮肤组织TBARS水平

组别	TBARS 水平(μmmol/L/100μg protein)
组别	9 天	19天
控制组	6.50 ± 0.73	6.73 ± 0.92
束缚组	10.56 ± 1.36^*	14.77 ± 1.55^*
束缚+Tempol	5.71 ± 1.11^#	2.41 ± 1.06^#

与控制组比较，*P<0.05，与束缚组比较，#P<0.05
表5不同应激天数各组小鼠皮肤组织SOD活性

组别	SOD 活性(U/100μg protein)
组别	9 天	19天
控制组	15.88 ± 0.32	15.66± 1.09
束缚组	13.64 ± 0.23^*	12.14± 1.13^*
束缚+Tempol	12.62 ± 0.69^*	8.14± 1.95^*

与控制组比较，*P<0.05
表6不同应激天数各组小鼠皮肤组织GSH-Px活性

组别	GSH-Px 活性(U/100μg protein)
组别	9 天	19天
控制组	482.00 ± 61.34	499.96± 29.27
束缚组	316.62 ± 24.39^*	280.02± 34.99^*
束缚+Tempol	427.45 ± 53.22^#	481.66 ± 87.26^#

与控制组比较，*P<0.05，与束缚组比较，#P<0.05
2.4 肉眼观察皮肤颜色变化
肉眼观察可以看出，脱毛后第9天，与控制组相比，束缚组皮肤呈粉色，灰度值显著升高（P＜0.001）；与束缚组相比较，束缚+Tempol组皮肤明显偏灰，灰度值显著降低（P＜0.05）。第19天，控制组皮肤已恢复粉色，与控制组相比束缚组皮肤颜色仍为黑色，灰度值显著降低（P＜0.001），与束缚组相比束缚+Tempol组皮肤呈灰色，灰度值显著升高（P＜0.05）（见表7）。
表7不同应激天数各组小鼠皮肤灰度率

组别	皮肤灰度率(%)
组别	9 天	19天
控制组	23.61 ± 1.77	33.38 ± 1.52
束缚组	44.99 ± 1.29^*	10.88 ± 0.56^*
束缚+Tempol	37.44 ± 1.49^#	18.22 ± 1.01^#

与控制组比较，*P<0.05，与束缚组比较，#P<0.05
2.5 组织形态学观察
脱毛后第9天，控制组毛囊多处于生长晚期（生长期IV-VI），毛囊平均分接近3分；束缚组毛囊多处于生长早期（生长期I-IIIa），毛囊平均分显著低于控制组（P<0.05）；束缚+Tempol组毛囊多处于生长中期（生长期IIIc-IV），毛囊平均分显著高于束缚组（P<0.05）。脱毛后第19天，控制组毛囊多处于退行中期（退行期IV-VI），毛囊平均分接近6分；束缚组毛囊多处于生长晚期（生长期V-VI），毛囊平均分仍显著低于控制组（P<0.05）；束缚+Tempol组毛囊多处于退行早期（退行期I-III），毛囊平均分显著高于CRS组（P<0.05）（见表8）。
表8不同应激天数各组小鼠毛囊平均分

组别	毛囊平均分
组别	9 天	19天
控制组	2.88± 0.12	5.52± 0.29
束缚组	1.71± 0.17^*	4.15± 0.13^*
束缚+Tempol	2.80± 0.19^#	5.04± 0.17^#

与控制组比较，*P<0.05，与束缚组比较，#P<0.05

3．讨论
应激可以引起机体内分泌、免疫、自主神经三大系统的改变，作为机体最外层的皮肤不仅接受外界刺激，同时也接受来自机体自身的生理性和情绪性应激源的刺激^[3]。应激引起皮肤病变的详细机制尚不清楚，但氧化应激已经公认是众多皮肤疾病的重要发病机制，可以诱导或加重诸如红斑、水肿、光老化、皱纹、过敏反应、炎症及皮肤癌等疾病^[5]。还有研究报道在斑秃病人的头皮组织中，TBARS水平、SOD、GSH-Px活力均明显升高^[¹²^]。而心理应激可以导致身体多器官发生氧化应激，提示氧化应激可能是心理应激导致皮肤病变的一个重要机制。在文献调研阶段罕见心理应激导致皮肤氧化应激的报道，故本研究利用慢性束缚法建模，观察到了束缚组小鼠皮肤TBARS水平显著升高，SOD、GSH-Px活力显著降低。TBARS涵盖了大部分氧化损伤产生的醛酮类物质, 因而被认为是衡量氧化应激所导致的脂质过氧化反应较好的指标。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化系统，能够抑制氧化反应和分解氧化产物，二者活力降低是造成氧化产物堆积进而对组织细胞造成损伤的重要原因。本实验还观察到给予抗氧化剂Tempol腹腔注射后，小鼠皮肤TBARS水平显著降低的同时，SOD活力也随之显著降低，可能因为Tempol与SOD结构相似而形成竞争性抑制有关。肉眼和形态学观察也发现束缚组毛囊生长期延迟，并且发现在给予腹腔注射抗氧化剂后能够改善，与实验室检测结果相一致。这进一步证明了氧化应激有可能是心理应激对毛囊周期产生影响的一条重要途径。
C57BL/6N小鼠是观察和研究毛囊周期的理想模型动物，其皮肤颜色呈周期样变化，休止期为粉色，生长期逐渐变为黑色，至退行期皮肤呈灰色，至静止期重新变为粉色。因此根据皮肤颜色可粗略地对毛囊进行分期^[11]。脱毛后第9天当控制组毛囊进入生长晚期时，模型组毛囊仍处于生长早期。腹腔注射Tempol可以部分的逆转应激引起的毛囊生长期延迟。第19天时结果与第9天相似，控制组毛囊周期仍领先于模型组。此结果说明慢性束缚应激导致了毛囊生长期的整体延迟，既静止期延长，参照Aoki等人的研究结果，提示慢性束缚应激具有与足底电击相同的抑制毛囊生长的作用。本实验中观察了束缚应激可影响脱毛后第1个生长周期，而足底电击只对脱毛后第2个生长周期有作用^[³^]，故毛囊对束缚刺激更加敏感。
慢性束缚应激可以造成动物的抑郁和焦虑状态，与足底点击法相比心理和情绪应激成分更为突出而躯体应激成分相对较小，可以较好的模拟人类慢性焦虑情绪和抑郁状态^[¹³^]。动物血清皮质醇水平显著升高，提示动物处于应激状态，行为学评估结果显示在开场实验初始3min内束缚组动物运动距离明显下降，提示其处于抑郁状态，证明了本次实验的动物模型是成功的。
综上所述，我们观察到慢性束缚应激可以导致毛囊的生长期延迟，这说明慢性的心理应激可以抑制毛囊的生长，并证实了氧化应激在此过程中起着关键作用，而抗氧化剂可以改善毛囊生长，此发现再次证明了精神心理因素在脱发中的重要作用，将氧化应激这一概念引入了心因性脱发的发病机制，为其治疗提供了新的思路。

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